碧波线粒体蛋白提取试剂盒

一、产品简介

本试剂盒用于从哺乳动物组织或细胞中提取线粒体蛋白。其原理首先是从动物组织或细胞中分离出完整而且纯化的线粒体，然后用含有蛋白酶抑制剂及***酸酶抑制剂的裂解缓冲液裂解线粒体得到纯度高的线粒体蛋白。

本试剂盒可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究。

二、试剂盒组份

三、试剂盒以外自备仪器和试剂

低温高速离心机、剪刀、微量移液器、1.5m L离心管、涡旋振荡器、相差显微镜下、PBS

四、保存条件：

-20℃保存一年有效。

五、注意事项：

1、   全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。

2、   微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。

3、   在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率。

4、   以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

5、   进行Western Blot和2D电泳，可直接加入样品缓冲液裂解线粒体。

6、   PMSF一定要在裂解液加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。

7、   本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。

8、   提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性剂。

9、   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

六、操作规程

（一）线粒体的提取

1、   样本的处理

A、  样品培养细胞裂解匀浆

a、    按照常规方法收集细胞。用PBS洗涤一次细胞并计数， 离心（2000rpm，5min）收集细胞，吸尽上清。每次提取需要5×10⁷个细胞。

b、   加入1.5mL预冷的裂解液1重悬细胞，冰浴放置10～15min。

c、  将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃～4℃冰浴用间隙严密的研杵研磨细胞30～40次。

（相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可）

d、   转入第2步进行操作。

B、组织裂解匀浆

a、    称取100～200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干。

b、   把组织放在一个置于冰上的离心管或培养皿中，用剪刀或刀片把组织剪切成非常细小的组织碎片。

c、    加入1.5 mL冰预冷的裂解液1，0℃冰浴上下研磨组织20次。

（相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可）

d、   转入第2步进行操作。

2、   将细胞或组织匀浆物转移到离心管，4℃，800×g离心5 min。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底。

3、   在另一个新的预冷的离心管中预先加入0.5mL 溶液A，将匀浆后的上清液0.5mL（溶液A：上清液体积=1：1）沿管壁小心地加入预冷的离心管中，覆盖于溶液A的上层。

4、    4℃离心（15,000×g 10 min）。离心后的上清为胞浆成分，将上清转移到新离心管，沉淀为线粒体。

5、   往沉淀中加入0.2 mL漂洗液重悬线粒体沉淀，4℃离心（15,000×g 10 min），弃上清。

（二）蛋白的提取

1、   裂解液2工作液的准备

在每1mL 冷裂解液2加入10μL***酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。

2、   每20μL线粒体压积中，加入200μL上述配制好的冷裂解液2工作液。

3、    置于4℃摇床平台上，温和振荡15 min。

4、    离心（12,000rpm，4℃）15min，取上清为线粒体蛋白提取物，蛋白定量（建议用BCA法）。

5、   分装保存于-70℃，避免反复冻融。