谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性测定试剂盒 |
型号:null 产品货号: SN101 |
价格:请致电:010-57128832,18610462672 |
品牌: 北京/中国 |
谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性测定试剂盒说明书 货号:SN101 规格:50管/48样 产品简介: 谷胱甘肽S-转硫酶(GST)是一种具有多种生理功能的蛋白质家族,主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分,主要催化各种化学物质及其代谢产物与谷胱甘肽巯基的共价结合,使亲电化合物变为亲水物质,易于从胆汁或尿液中排泄,达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此,GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外,因为GST具有GSH-Px活性,亦称为non-SeGSH-Px,具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。 GST催化GSH与CDNB结合,其结合产物的光吸收峰波长为340nm,通过测定340nm波长处吸光度上升速率,即可计算出GST活性。 试验中所需的仪器和试剂: 紫外-可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1ml石英比色皿、双蒸水 产品内容: 试剂一:试剂一×1支,用前充分溶解于100ml双蒸水中,4℃保存3个月 试剂二:粉剂二×1支;稀释液二×1管,用前将稀释液二加入粉剂二中充分溶解后加双蒸水至5.0ml,4℃保存3个月 试剂三:粉剂三×1支,4℃保存3个月,临用前加试剂一5.0ml充分溶解,临用前配制。 操作步骤: 一、样品测定的准备: 称约0.1g组织,加入1ml试剂一,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心10min,取上清(如上清不清澈,再离心3min)。 二、GST测定操作 1、 混合试剂配制:将试剂二与试剂一按1:8混合 2、 试剂三放在25℃预温 3、 分光光度计调到340nm处,设定时间为5min,用双蒸水调零 4、 取0.1ml样品与0.9ml混合液混合,于25℃预温5min,再加入试剂三0.1ml,迅速混匀,于340nm处测定5min内吸光值的变化,第0s的吸光值记为A1,第300s的吸光值记为A2 5、 空白管测定为操作4中以0.1ml试剂一代替0.1ml样品液 酶活计算: 一、 血液GST活性计算 1、 GST活力单位定义:在25℃下,每ml血液每分钟催化1μmol/L CDNB与GSH结合的GST酶量为1U。 2、 计算公式: GST(U/ml)=ΔA340/min×〔106/ (ε·d) 〕×(V总/V样)=ΔA/min×106/ (9.6×103×1) 〕×1.1/0.1 340 =ΔA/min×1145.83 340 △A340=△A测定管-△A空白管,△A测定管与△A空白管均等于(A2-A1)/5,即每分钟吸光值变化 3mol/L • cm ε:产物在340nm处摩尔吸光系数为9.6×10 106:摩尔分子换算成微摩尔分子 d :比色杯光径(cm) V总:反应总体积(ml) V样:所用样品体积(ml) 二、组织GST活性计算 1、 GST活力单位定义:在25℃下,每毫克蛋白每分钟催化1μmol/L CDNB与GSH结合的GST酶量为1U。 2、 计算公式: GST(U/mg)=△A340/min×[106/ (ε •d)]×(V总/V 样)÷Cpr =△A340/min×106/(9.6×103×1)×1.1/0.1÷Cpr =△A340/min×1145.83÷Cpr △A340=△A测定管-△A空白管,△A测定管与△A空白管均等于(A2-A1)/5,即每分钟吸光值变化 3 mol/L • cm ε:产物在340nm处摩尔吸光系数为9.6×10 106:摩尔分子换算成微摩尔分子 d:比色杯光径(cm) V总:反应总体积(ml) V样:所用样品体积(ml) Cpr:蛋白浓度(mg/ml) 注意事项: a) 样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力 b) 本法测定GST活性的线性范围可达76U/L,测定前先用1~2个样做预实验,如5min内反应不成线性,须对样品做相应稀释,稀释时用样品提取液稀释,计算结果乘以稀释倍数。 c) 测定反映的温度对测定结果有影响,请控制在25℃ 不同测定材料中GST酶液提取的注意事项 哺乳动物溶血液的配制: ①取肝素抗凝全血(人)20μL,以蒸馏水稀释至1mL,配成1:49的溶血液;取肝素抗凝全血(鼠)10μL加蒸馏水至1mL,配成1:99的溶血液。 ②充分混匀,放置5分钟直至使玻璃管中的溶血液对光呈完全透明状,方可进行检测。 ③已配好的溶血液中酶活力只能保持45-60分钟,天冷时可延迟至120分钟。如果当天来不及测定则以抗凝全血冰箱(4-8℃)保存,2-3天内酶活力变化不大。 哺乳动物组织中GST的提取:由于哺乳动物组织中酶活力较大,为保证灵敏度,要注意用试剂一将酶提取液进行稀释,肝脏稀释50倍左右,肾脏稀释20倍左右。计算酶活力时乘以相应稀释倍数。 细胞处理:收集约2× 104个细胞,冷冻干燥后,加入1 mL 试剂一。超声破壁细胞(950 W,30%,15 min,工作1 s间隔2 s),再经1,0000r 4℃高速离心10 min,上清待测。 其它步骤按照试剂盒说明书操作即可。 Solarbio Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd Tel: 010-56371210 Fax: 010-56371281/82 Http://www.solarbio.cn |