北京索莱宝 Fluo-3 钙离子荧光探针
英文名称: Fluo-3
型号:null    产品货号: S21010
价格:请致电:010-57128832,18610462672
品牌: 北京市通州区联东u谷85a三层
试剂级别: 生化级

 北京索莱宝科技有限公司 张净花 010-56371206 QQ:405465416

FLUO-3 钙离子探针的详细信息

细胞膜电位荧光探针编辑

DiBAC4(3)是一种细胞膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料,DIBAC4(3)本身无荧光,当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光,DIBAC4(3)进入细胞,细胞内荧光强度增加,即膜电位增加表示细胞去极化;反之,细胞内荧光强度降低即膜电位降低表示细胞超极化。DiBAC4(3)是目前最常用的线粒体膜电位检测荧光探针

钙离子荧光探针FLUO-3AM应用详解

Fluo-3AM的理化性质

颜色及形状:橘红色液体

纯度:,大于95%(高效液相)

溶解性:溶于DMSO

吸收波长/发射波长:506nm /526nm(/高钙)

消散系数:86000/Mcm(506nm)

保存与使用:粉状的FLUO-3AM应保存于-20度以上。建议使用DMSO作为溶媒。在溶解前,FLUO-3AMDMSO均须放置至室温。溶解过程可能会比较慢。用无水的DMSO溶解的FLUO-3AM长期保存,应严格密封,并保存于-20度。使用前,将保存液放置至室温后再打开。可避免AM探针在长期的保存过程中水解。

Fluo-3AM的工作原理

FLUO-3广泛用于长波长的荧光钙指示剂。其在506NM处被吸收,可以被氩离子激光的488nm激发光激发,便于检测。FLUO-3在没同钙结合的情况下,无荧光产生。但是,在与钙结合后,荧光(526nm)增强至少40倍。Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。Fluo-3 AM的荧光非常弱,其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。Fluo-3 AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3,从而被滞留在细胞内。Fluo-3可以和钙离子结合,结合钙离子后可以产生较强的荧光,最大激发波长为506nm,最大发射波长为526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右,发射波长为525-530nm

Fluo-3AM的应用

1、过程概述

用于细胞内钙离子检测时,Fluo-3 AM的常用浓度为5μM。通常用含有5μMFluo-3 AM的适当溶液和细胞一起在37孵育30-60分钟进行荧光探针装载,随后适当洗涤,洗涤后可以考虑适当再孵育20-30分钟以确保Fluo-3 AM在细胞内完全转变成Fluo-3。然后在流式细胞仪上进行检测。

2Fluo-3AM使用液的配置

100ugFluo-3AM,分子量是1219.9。按实际需要的摩尔浓度折算,无水DMSO溶解。一般配置成1~5mMDMSO储存液。如出现难溶现象,可以用20%F127DMSO溶液助溶。

四、注意事项:

1、荧光染料有淬灭问题,应尽量避光保存;

2、实验时注意个人防护,戴手套、口罩;

五、应用举例

2、贮存液的配制(5000μM/L

按照说明书,计算0.1mg 的摩尔数为0.089μM ,则需加DMSO18uL,微量加样器反复吹打混匀后分装,按说明书要求避光-20度冰冻保存。

(二)

每毫升细胞悬液中加入1 uL,则Fluo-3AM的使用终浓度为5μM/L

Hoechst 33258染色

固定液 50 ml

Hoechst 33258染色液 50 ml

抗荧光淬灭封片液 5 ml

说明书 1

保存条件:

4保存,Hoechst 33258染色液需4避光保存。本试剂盒自订购之日起六个月内有效。

注意事项:

Ø 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

Ø PBS0.9%NaCl溶液。

Ø 需盖玻片与载玻片。

Ø 荧光物质均易发生淬灭,染色后的样品宜避光保存。

Ø 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭,但仍宜尽量避光。

3使用说明编辑

1. 贴壁细胞

A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间,无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS0.9%NaCl等溶液洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为50%-80%满。

B. 刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入0.5ml固定液,固定10分钟或更长时间(可4过夜)。

C. 去固定液,用PBS0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。

D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。也宜用摇床,或手动晃动数次。

E. PBS0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。

F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,尽量避免气泡。使细胞接触封片液,切勿弄反。

G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左右,详细图谱请参考下图。

悬浮细胞

A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内,加入0.5ml固定液,缓缓悬起细胞,固定10分钟或更长时间(可4过夜)。

B. 离心去固定液,用PBS0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。洗涤期间手动晃动。

C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀。

D. 稍晾干,使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

E. 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体,微晾干。

F. PBS0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。

G. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。

H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右,发射波长在460nm.

3

. 组织切片

A. 对于任何常见切片,处理至常规可以进行免疫染色时,或完成常规的免疫染色后,即可进行后续的Hoechst染色。

B. PBS0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。可在六孔板中操作。

C. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。也宜用摇床,或手动晃动。

D. PBS0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。

E. 将切片置于载玻片上,滴一滴抗淬灭封片液,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。

F. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左右,

Hoechst 33258的吸收光谱和发射光谱,左侧峰为吸收光谱,右侧峰为发射光谱。

DAPI染核

原理

主要结合dsDNA;结合小沟的ATDAPI也结合RNA,但其发射峰波长(500nm)要长于DAPI/dsDNA460nm)。

DAPI dilactate更水溶。在用于组织染色、未固定细胞和组织染色时,下述方法可加以修改。

保存:

10mg/单位,室温避光保存,小瓶内至少一年。制stock液,溶解100uM DAPI dihydrochloride二盐酸化物分子量为350.3DAPI dilactate分子量为457.5DAPI于去离子水中或DMF(二甲基甲酰胺)4避光可保存6个月。

DAPI是诱变剂,水溶液可通过活性炭去除,要安全处理。

染色:

在所有染色完成后进行复染,不需要另外的固定和通透处理。

4荧光显微镜复染方法编辑

1. PBS平衡

2. PBS稀释DAPI stock液至300nM,滴加300μL这种稀释液于细胞上。

3. 孵育5分钟。

4. PBS中涮洗几次,涳干过量缓冲液,抗淬灭剂封片。

FISH复染:

样品在dH2O中洗以去除残留缓冲盐溶液,有助于减少玻片上非特异背景。

1. PBS中稀释至30nM,吸300μL滴于样品上,塑料玻片有助于平均分配染料。

2. 黑暗室温孵育30分钟。

3. 去掉盖玻片,PBSdH2O中小心盥洗。

4. 去掉过量液体,绵纸在样品边缘小心吸取。

5. 盖上盖玻片,蜡或指甲油封片。或按供应商的指导加抗淬灭剂。

荧光显微镜观察。

Rhodamine 123 染色

中文名称:罗丹明 123

的:测细胞内线粒体的跨膜电位

EX/EM 505/534

染液配制: 罗丹明123 粉剂用甲醇配制成1mg/ml的储备液,100ul/支分装,-20保存。染色时用Dulbecco’s PBS缓冲液将其稀释为5ug/ml

染色步骤:

培养细胞

Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗23(缓冲液预热至室温或37)

Rhodamine 123(5ug/ml) 37孵育1小时

Dulbecco’s PBS缓冲液漂洗23

0.5ml Dulbecco’s PBS,上机测量

Fluo-3-AM 染色 (测细胞内游离钙离子浓度)

染液配制:Fluo-3-AM 50ug溶于45ul DMSO(Fluo-3-AM浓度 1mM)15ul/支分装,-20保存。染色时用1550mM HEPES缓冲液将其稀释为120uM(1.5ml 10uM)

染色步骤:

培养细胞

缓冲液漂洗23

Fluo-3-AM (120uM) 37或室温孵育0.51小时

缓冲液漂洗23

0.5ml 缓冲液,上机测量。

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