Coelenterazine f 腔肠素f 背景描述

腔肠素（Coelenterazine）是自然界中资源最丰富的天然荧光素，是绝大多数海洋发光生物（超过75%）的光能贮存分子。腔肠素可作为许多荧光素酶的底物，比如海肾荧光素酶（Rluc），Gaussia分泌型荧光素酶（Gluc），以及包括水母发光蛋白（aequorin）和薮枝螅发光蛋白（Obelia）在内的光蛋白（Photoproteins）。其发光原理是：以腔肠素为底物的荧光素酶在有分子氧的条件下，氧化腔肠素，产生高能量的中间产物，并在此过程中发射蓝色光，峰值发射波长约为450~480nm。与甲虫（或萤火虫）荧光素/荧光素酶系统不同，腔肠素/荧光素酶系统不需要三***酸腺苷（ATP），因此更便于体内生物荧光的研究。因此，腔肠素常用作基于荧光分析的报告基因检测以及活体动物检测的发光底物。

腔肠素还能在酶非依赖性的氧化体系中自发荧光，细胞和组织内的超氧阴离子和过氧化亚**阴离子能够增强该自发光信号，因此其也可用来检测细胞/组织内活性氧（ROS）水平。

腔肠素具有能量转移的特性— —生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET），利用此特性，当与荧光蛋白如GFP的突变体（增强的黄色荧光蛋白，EYFP）联合使用，在底物腔肠素存在的情况下，荧光素酶（如Rluc）催化底物发生蓝光，能量随之转移到EYFP上，发出绿光（~530nm）。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者间的相互关系来评估，适用于研究蛋白-蛋白之间的相互关系。另外，由于BRET的信号可通过比较绿光和蓝光的量来进行测定，消减了因细胞数、细胞类型和其他实验变量而引起的数据变量，适用于高通量筛选如药物开发。

更为重要的一个功能，水母发光蛋白复合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔肠素组成。只有当钙离子（Ca²⁺）与该复合物结合后，腔肠素才能被氧化生成高能量产物Coelenteramide，同时释放出CO₂和蓝色荧光（~466 nm）。正是此Ca²⁺依赖性的反应过程（见图1），使得腔肠素非常适用于监测活细胞内钙离子水平。与常规的荧光钙离子指示剂相比，其主要具有以下几个优点，1）能检测较大范围的钙浓度 – 从0.1 μM至 >100μM；2）样品无自体荧光，背景荧光低于使用荧光钙离子指示剂；虽然信号比使用荧光钙离子指示剂弱，但是通过成像仪器可以得到更高的信噪比，因此具有更高的灵敏度。3）水母发光蛋白复合体能够稳定维持在细胞内，使其能够进行数小时至数天的钙离子监测。 

图1. 腔肠素作为水母发光蛋白辅助因子的Ca²⁺依赖反应流程

目前商业化的腔肠素应用最普遍的是天然腔肠素（Coelenterazine native），另外还有很多腔肠素衍生物如Coelenterazine h、Coelenterazine 400a、Coelenterazine cp、Coelenterazine f、Coelenterazine hcp、Coelenterazine n等被一一合成。理论上这些腔肠素可用于相同的实验，但是由于其发光波长，细胞膜渗透性，光量子效率上的差异，使得其在相同应用上表现出不同的实验效果。因此非常有必要根据具体实验目的选择最合适的腔肠素底物（见附录1，腔肠素及其衍生物的特性）。

Coelenterazine f 腔肠素f 产品描述

本品为粉末形式供应的腔肠素f（Coelenterazine f），与天然腔肠素结构上的唯一差别在于将其R-1位酚基上的羟基替换成氟（F），是水母发光蛋白（aequorin）的首选底物。当腔肠素f和水母蛋白（Apoaequorin）一起被部分氧化得以活化，生成腔肠素的亚稳态复合物（aequorin）。与天然腔肠素-水母蛋白（Apoaequorin）复合物产生的光子总数相比，此复合物仅产生80%的光子能。但是其优点在于：仅需非常少的时间来生成aequorin复合物（通常来说此步反应很慢，比如60min内仅有40%的天然腔肠素完成反应）。另外，当其与Ca²⁺接触，即可快速且高产量的发光，产能强度是天然腔肠素的20倍。具有最好的细胞渗透性。当需要极高的Ca²⁺检测灵敏度来研究水母蛋白再生实验，推荐使用本底物。

Coelenterazine f 腔肠素f 产品性质

英文别名（English synonym）	CLZ-F; CLZN-F; Coelenterazine-Fluoride; 8-benzyl-2-(4-fluorobenzyl)-6- (4-hydroxyphenyl)imidazo[1,2- a]pyrazin-3(7H)-one
CAS号（CAS NO.）	123437-16-1
分子式（Formula）	C26H20FN3O2
分子量（Molecular weight）	425.46
外观（Appearance）	黄色至褐色粉末
溶解性（Solubility）	溶于甲醇或者乙醇，不可溶于DMSO
纯度（Purity）（TLC）	>95%
结构（Structure）

运输和保存方法

冰袋运输。粉末-20℃避光干燥保存，最好保存在惰性气体下以避免接触空气。
使用方法

1.        腔肠素f工作液的配制

腔肠素f溶解特性：腔肠素f不溶于水，接触空气，水或者任何氧化试剂变得不稳定。切忌溶于DMSO，因为未知或者未研究的反应发生，引起底物的快速降解和未知降解物生成。目前毒性最低的溶剂是100%乙醇，可配制0.1-1mg/ml溶液，然后加入缓冲液，尽量调整缓冲液pH值低于7.0，因为碱性pH会快速降解底物，有时即刻沉淀腔肠素f。

腔肠素f保存特性：最好的方法是使用前将冻干粉溶于乙醇溶液，然后稀释到工作缓冲体系。对于体外实验，需要将稀释好的工作液室温放置20-30min，以达到稳定。此时准备好的底物工作液可放置几个小时，仅可能有非常微弱的信号衰减发生（如室温放置3-4h）。不建议将腔肠素f的乙醇储存液放到-20℃或者更低温度保存，因为其高能量的二氧环丁***结构即使在低温的情况下也会瞬时降解，导致荧光强度明显变弱。若一定要以储存液的形式短时间保存，-70℃避光保存于塑料管内（溶液中不能含有Ca²⁺），且保护在惰性气体内。

Coelenterazine f 腔肠素f 注意事项

1）     腔肠素f粉末最好使用惰性气体-氮气或氩气，在密封良好的塑料管中避光保存于-20℃，长期保存于-70℃。管内即使有少量空气进入，也可能造成f氧化失活，使量化分析的结果难以在不同试验间进行比较。

2）   为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。