Altered Sites® II Mammalian invitro Mutagenesis System 英文名称: Altered Sites® II Mammalian invitro Mutagenesis System | ||||||||||||
型号:null 产品货号: Q5590 | ||||||||||||
价格:请致电:010-57128832,18610462672 | ||||||||||||
品牌: usa | ||||||||||||
Altered Sites® II Mammalian invitro Mutagenesis System Q5590的产品组分 Altered Sites® Ⅱ Mammalian Mutagenesis Systems (a, b, c)(Altered Sites® Ⅱ哺乳动物突变系统)提供了一种制备和筛选寡聚核苷酸介导的突变的高效方法。本系统提供的试剂可以突变双链(ds)或单链(ssDNA)DNA模板,并且无须亚克隆即可进行下一轮突变。无需亚克隆在哺乳动物细胞中表达序列也成为可能。本系统使用抗生素筛选的方法得到高频率突变。pALTER®-MAX Vector含有氨苄青霉素和氯霉素抗性基因,但是氨苄青霉素抗性基因是被失活的。在突变反应中,氨苄青霉素修复寡核苷酸和特异性突变核苷酸与DNA模板的同一个链退火杂交。接下来突变链的合成与连接使两个区域相连,从而使氨苄青霉素抗性恢复并导入了所需突变。在反应的初始阶段可以加入氯霉素敲除寡核苷酸,使氯霉素转乙酰酶基因失活,这样就可以进行下一轮突变和抗生素筛选,而无须亚克隆。 注意:本系统中不含有感受态细胞。 特点 操作手册 Technical Manual TM041 储存条件:细菌菌株储存于
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2)反应条件:根据引物的退火温度及目的片段大小确定PCR反应程序。
3)建议进行PCR产物纯化。如果PCR片段是从质粒模板扩增的,且该质粒与重组载体具备相同的抗性,建议将PCR体系中的质粒模板用DpnI进行消化。
5.2. 如意连反应体系
Vector | 1μl |
Inserts | 1-50ng |
10x Buffer | 2μl |
Enzyme Mix A | 1μl |
ddH2O | 加水至20μl |
总体系 | 20μl |
5.3. 连接反应
体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。37℃反应10 min(亦可在室温条件下进行反应,但克隆数会减少数倍,而克隆正确率不会变化,建议尽量在37℃条件下进行反应),待反应完成后,可将反应产物直接进行转化;也可储存于-20℃,待需要时解冻转化。
5.4. 重组产物转化、涂板
1) 取10 μl连接反应液,加入到100 μl感受态细胞中,将溶液混匀,冰上放置30 min。
2)42℃热激45秒,冰水浴孵育5 min。
3) 加入500 μl SOC培养基,37℃摇菌30 min。
4) 4000rpm离心5min,弃上清,留100 μl将沉淀打散,将菌液均匀涂布在含有卡那霉素的平板上。将平板倒置,于37℃培养12-16小时。
5.5. 阳性克隆鉴定
1)测序:直接将2-3个细菌克隆,送给测序公司,使用通用引物进行测序。
2)限制性内切酶酶切鉴定法:挑选2-3个细菌克隆接种于卡那霉素的液体培养基中,过夜培养。使用质粒抽提试剂盒提取质粒,根据载体信息选择适宜的限制性内切酶进行酶切鉴定。
l Tips
1. PCR产物纯化后连接效率会更高。
2.提高PCR产物浓度,连接效率会更高。
3.在建议温度范围内(22-37℃),提高温度有助于提高连接效率。冬季室温较低,建议在水浴锅内37℃反应增加克隆数。
4.在第一次使用如意连试剂盒时,建议把试剂盒中的control insert也按说明书进行操作,完成连接反应,保证操作没有问题。