中国/美国<br>试剂级别：分子生物学级Brand,null 产品货号： 11203YB03Item#, HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)<br>英文名称： HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)

产品信息

产品名称

产品编号

规格

储存

价格（元）

促销价（元）

Hieff^TM qPCR SYBR^® Green

Master Mix (High Rox Plus)

11203YB03

1 ml (40rxn(25µl/rxn))

-20℃避光

180

11203YB08

5×1 ml (200rxn(25µl/rxn))

-20℃避光

740

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)产品描述

Hieff^TM qPCR SYBR^® Green Master Mix(No Rox Plus)是2×浓缩的实时定量PCR扩增的预混合溶液。Mix中含有热启动Hieff^TM DNA Polymerase，SYBR^® Green I，dNTP Mix，Mg²⁺，Rox 参比染料。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染几率。

本品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化，实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了可有效抑制非特异性PCR扩增因子与促进PCR反应扩增效率的因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

本产品中预先添加了独特配方的高浓度Rox 参比液，用于校正不同孔间的荧光信号误差。

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)适用机型

本产品中含有用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差的高浓度Rox Reference Dye，适用于以下荧光定量PCR仪：

ABI 5700、7000、7300、7700、7900、7900HT、7900HT Fast Real-Time PCR System

ABI StepOne^TM、StepOne Plus^TM

其他需要添加高浓度Rox Reference Dye的荧光定量PCR仪

运输与保存方式

冰袋运输，-20℃避光储存，有效期1年。

尽量避免反复冻融，如每次使用量较少，推荐小份分装使用。

HieffTM qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus)操作流程

【注1】：由于本品检测灵敏度极高，即使空气中微量的DNA气溶胶都可以引起污染，进而导致实验失败。因此反应体系配制时请于超净工作台内进行，配制过程中请使用干净灭菌枪头、反应管，条件容许的实验室推荐使用专用的移液枪，避免交叉污染。推荐使用带滤芯的枪头。

【注2】：由于本品中含有荧光染料SYBR^® Green I，因此无论保存还是配置反应体系时都应该尽量避免强光照射。

1．使用前务必充分混匀Mix，混匀时避免剧烈震荡以免产生过多气泡。Mix轻微离心后即可使用。

2．qPCR反应体系配制^*

试剂	体积（50 μl）	体积（20 μl）
Hieff^TM qPCR SYBR^® Green Master Mix (High Rox Plus)	25μl	10 μl
Forward Primer（10 μM）	1μl	0.4 μl
Reverse Primer（10 μM）	1μl	0.4 μl
模板DNA	X μl	X μl
无菌超纯水	Up to 50 μl	Up to 20 μl

【*】：反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整：

a）反应体系中引物浓度一般在0.1-1.0 μM之间，通常引物终浓度为0.2 μM扩增效果较好；

b）扩增产物长度请选择在100 bp-300 bp范围内，尤其推荐100 bp-150 bp之间；

c）模板参照体系：1µg RNA的反转录产物需要稀释10-20倍后再进行使用，以减轻RNA对PCR扩增的抑制效应。

d）推荐您使用20μl 或者50 μl反应体系，反应体系适合，才足以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

3．PCR 反应条件

本产品可以用三步法进行，也可以用两步法程序进行PCR扩增反应。

【三步法程序】

95℃	5 min	预变性
95℃	10 sec	循环反应（40 cycles）
55-60℃	20 sec
72℃	20 sec
95℃	15 sec	熔解曲线
60℃	60 sec
95℃	15 sec

【两步法程序】

95℃	5 min	预变性
95℃	10 sec	循环反应（40 cycles）
60℃	30 sec	循环反应（40 cycles）
95℃	15 sec	熔解曲线
60℃	60 sec
95℃	15 sec

【注】：a：预变性时间根据自己模板和引物的情况可适当缩短至1min—2min。

b：引物退火温度和时间，请根据引物和目的基因的实际情况自行调整。

c：2步法无法扩增的基因，建议采用3步法扩增。

d：熔解曲线采集程序可根据您使用的Real Time PCR仪自行调整，通常情况下使用仪器默认程序即可。

4．分析。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线及熔解曲线，进行标准曲线制作等。首次实验需要用琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物的特异性。

1）对荧光定量而言，Ct值落在20-28之间定量最为准确。如果Ct值太小，请稀释模板后重新进行试验；Ct值大于35时，Real Time PCR检测无效，目标基因无表达；当Ct值介于32-35之间时，需要至少三个重复才能判断目标基因是否表达。

2）如果反应特异性好，无非特异性扩增产物产生，无引物高级结构，则熔解曲线应该是单峰曲线，此时定量结果有效；若熔解曲线出现显著多峰，则定量结果无效，请优化条件重新进行定量实验。引物设计不合理而导致的引物二聚体同样会影响实验结果的判定。

3）使用本品进行绝对定量需自行绘制标准曲线；进行相对定量可根据下述公式计算目标基因表达情况：

设定Ct^A1为1号样本目标基因Ct值，Ct^B1为1号样本内参基因Ct值；Ct^A2为2号样本目标基因Ct值，Ct^B2为2号样本内参基因Ct值，则1号样本和2号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为（2^-^△△^Ct法）：

△△Ct =（Ct^A2-Ct^B2）-（Ct^A1-Ct^B1）= X，则2号样本内目标基因的表达水平为1号样本内的2 ^-X 倍。

【注】：上述计算方法是假定扩增效率为100% (每个循环过后产物量为前一循环产物量乘以2)，如实际扩增效率不为100%，需根据实际扩增效率修改计算公式。例如：目标基因和内参基因扩增效率为0.90，则计算公式应该修正为(1+0.90)^-^△△^Ct。

引物设计指南

1）扩增产物长度100bp-150bp为佳。重要！

2）引物长度17 bp-25 bp最好。太短的引物容易导致扩增效率降低，太长的引物会导致引物高级结构出现几率增加；

3）引物的3’端应尽量避免高GC或高TA含量区域；

4）引物3’端最后一个碱基最好为G或者C，避免使用T；

5）正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超过1℃。Tm值调整至60℃-65℃为佳。（引物Tm值推荐使用Primer 5进行计算）。

6）引物的GC含量控制在40%-60%之间，最佳为45%-55%；

7）引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域；

8）尽量避开T/C或者A/G的连续结构；

9）避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列，二条引物之间的3’端避开有2个碱基以上的互补序列；

10）引物设计完毕使用NCBI BLAST功能检索核对引物特异性，以避免非特异性扩增产生。

qPCR反应有效性确认标准

1）线性关系以及扩增效率确认：

标准曲线相关系数（R²）＞0.98

标准曲线斜率介于 -3～-3.5之间

PCR扩增效率（E）介于0.9～1.2之间

2）重复性确认：

重复管之间的STD＜0.2

3）特异性确认：

扩增产物融解曲线无明显非特异性扩增产物/引物二聚体杂峰（必要时请进行琼脂糖电泳进行确认）。