一、概述

Mbchem™  Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒可以方便快捷的检测细胞凋亡情况，使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备进行检测。

l 方便：可用流式细胞术或荧光显微镜检测；

l 快速：1 小时内即可完成实验；

l 准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。

   本试剂盒适用于检测活细胞，不适用于检测组织样本。

二、产品简介

细胞凋亡普遍存在于生物界，既发生于生理状态下，也发生于病理状态下。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生（morphogenesis）、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用。

在正常细胞中，***脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35.8KD的Ca2+依赖性***脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V 进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

 图1、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒原理

***化丙***(Propidine Iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来(图1)。

 

三、试剂盒组分

n Annexin V-FITC：rh Annexin V由E.coli表达, 20μg/ml储存在Tris-HCl (20mM), NaCl(50mM) 缓冲液中，含1mg/ml BSA。

n 1×Binding Buffer:  Hepes(10 mM) /NaOH (pH 7.4), NaCl (140 mM), CaCl₂，(2.5 mM). 经0.2 μm孔径过滤器除菌。

n ***化丙***染色液: 25 μg/ml 溶于PBS (pH7.4)中。

注意：

  1、Annexin V-FITC和***化丙***染液应该避光存放和使用。

  2、***化丙***有毒，应小心保存和使用，注意个人保护。

四、保存条件

    试剂盒所有组分2-8℃避光保存，保质期一年。生产日期请见包装。

五、试剂盒以外自备试剂和仪器

v PBS

v 蒸馏水或去离子水

v 分离收集细胞用的离心机

v 流式细胞仪或荧光显微镜

v 微量移液器

六、操作步骤

ü   操作注意事项 

Ø 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此我们建议您最好在着色后立即进行分析。

Ø 操作过程中应该带上橡胶或一次性手套，避免接触皮肤。

Ø 对可能产生污染的器皿/试剂进行清洗并做灭菌处理，最好的方法是在121.5°C高压灭菌1小     时。

Ø 如果您需要固定细胞，请在固定前先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育，并用Annexin V-FITC结合液洗掉未结合的Annexin V。因为固定产生的细胞碎片可以和Annexin V结合，对结果产生干扰。

Ø 如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200×g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。

Ø 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

Ø 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

Ø Annexin V-FITC 和Propidium iodide 是光敏物质，在操作时请注意避光。

Ø 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS 的密度、发生凋亡时PS 翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。

ü 样品着色

    1. 离心收集悬浮细胞，微量离心机转速2000RPM，离心时间5min，弃培养基。

       （贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）

    2. 用冷PBS 洗涤细胞两次（2000RPM，离心时间5min收集细胞）。

    3. 用400ul 1X Binding Buffer 悬浮细胞，浓度大约为1 X 10⁶ cells/ml。

    4. 在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C 避光条件下孵育15 分钟。

5. 加入10ul PI 后轻轻混匀于2-8°C 避光条件下孵育5 分钟。

6. 在1 小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

A、流式细胞仪分析

经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。

    流式细胞仪激发光波长采用Ex.= 488nm双波长激发，Em.= 530 nm检测FITC荧光和>575 nm的发射检测PI。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2或FL3）检测，建议使用FL3。细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。

    使用流式细胞仪正确分析Annexin V-FITC/PI 双染的细胞前要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。因为荧光补偿设置与PMT 的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。建议在实验开始阶段分析经Annexin V、PI 分别单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。根据未处理细胞空白对照和经Annexin V、PI 分别细胞染色后的单染对照的分析设定十字门的位置。

1. 上样未经染色的细胞，在线性FS-SS 点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。

2. 建立LogFL1-LogFL2（最好用FL3）双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98的细胞处于在X、Y 轴Log 1 为边界的左下象限中心区域。

3. 检测Annexin V-FITC 单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在左上和右上象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在上端象限则说明有荧光渗漏；此时FL1 的荧光被FL2 （或FL3）PMT检测到了。为了纠正这种现象，增加FL1 漏到FL2（或FL3）荧光的补偿（这可能在1-5之间）。如果这个调节没有有效地去除FL2 的阳性信号，此时要降低FL2（或FL3） PMT 的电压。

4. 检测PI 单染的细胞并检查FL1-FL2（或FL3）散点图，保证在右上和右下象限内没有颗粒。如果有颗粒出现在右侧象限则说明有荧光渗漏；此时PI 的荧光被FL1 PMT 检测到了。为了纠正这种现象，增加FL2（或FL3）漏到FL1 荧光的补偿（这可能在15-25之间）。如果这个调节没有有效地去除FL1 的阳性信号，此时要降低FL1 PMT 的电压。

注：如果在以上调节补偿过程中更改了PMT 的电压，建议重复3、4 步骤，确保不引起过度荧光补偿。过度补偿可以从阳性细胞十分贴近从标这一现象观察出来。一个恰当的补偿应该是单阳性细胞荧光强度与落在左下Log 1 为边界象限中间阴性细胞的荧光强度一致。

5.设定十字门的位置，FL1 和FL2（或FL3）的划定方法如下：

5.1 设定FL1 标尺位置: 处于左下象限内的大群细胞是Annexin V 染色阴性的细胞（一般这些细胞会在FL1 轴方向上升至2 个对数坐标值）。将垂直的FL1 标尺设定在紧靠Annexin V 阴性群体右侧0.1-0.2Log 单位的地方。

5.2 设定FL2 （或FL3）标尺位置: 可以通过一定数据的双阳性细胞来区分PI+和PI-的细胞群体。在此条件下可能会识别出两群细胞，一是位于散点图的右下方（ANN+/PI-）还有就是右上方（ANN+/PI+）。水平线可以置于这两群细胞的中间。如果在分析的细胞群体中没有PI+细胞，区分PI+细胞最好是参照双阴性细胞群体，将水平线设在双阴性细胞以上0.1-0.3 Log 单位的地方。

注：在阴性群体门以外的细胞可被识为 Annexin V 或Annexin V 和PI 阳性的细胞。

  B、荧光显微镜观察

1． 悬浮细胞染色后，滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。

2． 贴壁细胞可以象悬浮细胞那样染色后， 滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，

荧光显微镜下观察。

贴壁细胞也可以先在盖玻片上培养（根据盖玻片大小，置于24孔或12孔细胞培养板内），然后诱导细胞凋亡。染色细胞在细胞培养板内进行。先用PBS冲洗两次，加入400μl Binding Buffer于孔中。再加入5μl Annexin V-FITC与10μl Propidium Iodide，混匀. 避光室温反应10分钟。

3． 将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察呈绿色的Annexin V-FITC荧光信号和PI红色荧光信号。

七、相关产品

M3023-1	Annexin V EGFP/PI双染法凋亡检测试剂盒	25 assays
M3023-2	Annexin V EGFP/PI双染法凋亡检测试剂盒	50 assays
M3023-3	Annexin V EGFP/PI双染法凋亡检测试剂盒	100 assays
M3023-4	Annexin V EGFP/PI双染法凋亡检测试剂盒	400 assays
M3036-1	1×Annexin V Binding Buffer	100ml
M3036-2	10× Annexin V Binding Buffer	100ml
M3031	Annexin V FITC Reagent	1000 assays
M3032	***化丙***	20mg