T4 DNA Ligase 产品描述

T4 DNA Ligase在ATP做辅酶的情况下可催化dsDNA 平末端或粘性末端相邻核酸的5’***酸末端和3’羟基末端形成***酸二酯键，还可催化RNA和双链中的ssDNA 或RNA 链连接，但不能催化全单链核苷酸间的连接。

本品主要适用于标记RNA 3’-末端，环化RNA和DNA寡聚核苷酸以及克隆cDNA等核酸操作。

 T4 DNA Ligase 产品组分

组分编号	组分名称	规格
10301-A	T4 DNA Ligase(400U/µl)	100µl
10301-B	10×Ligase Buffer	1ml

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃保存。

单位定义

在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-HindⅢ分解物在16℃下反应30min时，催化50%以上的DNA片段发生连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。

质粒控制

核酸外切酶残留检测：2000 U的本品和0.6 μg λ-Hind III在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测：2000 U的本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74℃下反应1小时，DNA电泳谱带不发生变化。

 T4 DNA Ligase 注意事项

1）Buffer在融解时，如果出现少量沉淀属正常现象，请颠倒混匀后使用。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 T4 DNA Ligase 使用方法

1. 在无菌微量离心管中配制以下反应体系：

10×Ligase Buffer	1µl
插入片段*	0.3pmol
载体DNA*	0.03pmol
T4 DNA Ligase (400U/µl)	1µl
ddH2O	To 10µl

【*注1】：插入片段与载体的摩尔比应在3:1-10:1之间。

【*注2】：平末端载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去***酸化处理，以防发生自连接现象。

2. 16℃反应过夜；

3. 转化

1）将连接产物加入到100µl 感受态细胞中（连接产物不应超过感受态细胞的1/6），轻弹混匀，冰上孵育30min。

2）将离心管于42℃，热激90s（不要晃动），之后立刻置于冰水浴静置2-3min。

3）向离心管中加入900µl LB或SOC培养基，37℃，150rpm，振荡培养45min，该过程使菌体复苏，抗性基因表达。

4）2500g 离心5min，吸去900µl上清，用剩余培养基重悬菌体，用无菌涂布棒将剩余菌体在正确抗性的平板上涂布均匀，待菌液被平板吸收后，37℃倒置培养过夜。

【注】：如果使用超级感受态细胞（转化效率＞10⁸cfu/µg），可直接吸取100-200µl 37℃孵育后的菌液涂板，剩余菌液可在4℃保存，1周内都可重新涂板。