产品信息

产品名称	产品编号	规格	储存	价格（元）
2×HieffTM HotStart PCR Master Mix (With Dye)	10111ES03	1ml	-20 ºC	96.00
2×HieffTM HotStart PCR Master Mix (With Dye)	10111ES08	5×1ml	-20 ºC	432.00

产品描述

2×Hieff^TM HotStart PCR Master Mix是即用型的PCR预混合溶液，含有HotStart DNA Polymerase，dNTP以及优化的缓冲体系，只需加入引物和模板即可进行扩增，大大简化实验的操作步骤，提高了高通量操作和实验结果的重现性。Mix中加入电泳缓冲液和染料，使得PCR产物可以直接进行电泳，染料的存在不会干扰扩增效率。体系中含有的保护剂使得Mix经过反复冻融后仍可维持酶的活性以及产品的稳定性。PCR产物具有3’-dA突出端，可轻松克隆至T载体。

产品信息

编号	组 分	产品编号/规格
		10111ES03(1ml)	10111ES08(5×1ml)
10111-A	2×HieffTM HotStart PCR Master Mix (With Dye)	1ml	1 ml×5
10111-B	超纯水（PCR Grade）	1ml	1 ml×5

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

活性定义                    

用活性化的大马哈鱼精子作为模板/引物，在74ºC，30min内摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。

质量控制

核酸外切酶残留检测：20 μl本品和0.6 μg λ-Hind Ⅲ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。

核酸外内酶残留检测：20 μl本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时, DNA的电泳谱带不发生变化。

大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，以ddH₂O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。

功能检测：50 μl体系中，以30 pg人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。35个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的360 bp条带。

应用实例

1.        反应体系配制（50μl）：

模板DNA§	optional
引物1（10 μM）	2 μl
引物2（10 μM）	2 μl
2×HotStart PCR Master Mix (With Dye)	25μl
ddH2O	up to 50μl

§ 针对不同模板的最佳反应浓度有所不同，下表为50μl反应体系推荐模板使用量，仅供参考。

人基因组DNA	1～500 ng
大肠杆菌基因组DNA	1～100 ng
λDNA	0.1～1 ng
质粒DNA	0.1～1 ng

2.  PCR循环反应条件

95℃	5 mina（预变性）
95℃	30 sec	35个循环
55℃b	30 sec
72℃	60 sec/kb
72℃	7min（彻底延伸）

a. 如扩增不理想，可适当延长95℃预变性时间，最长可至10 min。

 

b. 退火温度需要根据引物的Tm值调整，一般设置成低于引物Tm值1-2℃即可。

引物设计注意事项

1.   引物3’端最后一个碱基选择C或G；

2.   引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；

3.   引物3’端尽量避免发卡结构的出现；

4.   引物Tm值控制在55℃-65℃之间；

5.   引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；

6.   引物GC含量控制在40%-60%之间；

7.   正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。