英文名称： Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag亲和纯化凝胶）
Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag亲和纯化凝胶）
Anti-Flag亲和纯化凝胶（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel）由高质量的鼠源IgG2b单克隆抗体与Sepharose 4B gel通过供价偶联制备，本产品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量（至少为1.1mg protein/mL凝胶），杂蛋白非特异结合少，可用于带有Flag标签的融合蛋白免疫沉淀（IP）和纯化。产品描述
Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag亲和纯化凝胶）可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）。
产品性质
运输和保存方法
冰袋运输。未开封的产品在-20℃下可稳定保存1年。禁止在不含甘油的溶液中冻存！
注意事项
1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作
使用方法
一、制备细胞裂解液（以哺乳动物细胞为例）
注意：样品中不能含有颗粒不溶物，可以用0.22μm滤膜过滤或10,000×g离心15min；如有必要，可以加入蛋白酶抑制剂；如样品太粘稠，可以加入核酸酶处理。
细胞密度70-90%，100mm培养皿（约106-107细胞），加入1mL裂解液（50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1%Triton X-100）。推荐加入蛋白酶抑制剂Cocktail（Cat 20123ES）。
1）清洗细胞
贴壁细胞：去除生长培养基，用PBS洗2次，去除PBS，加入裂解液（106-107 cells/mL）。
悬浮细胞：细胞转移到离心管中，420×g离心5min，去除上清。用PBS重悬，420×g离心5min，重复1次，去除上清，加入裂解液重悬（106-107 cells/mL）。
2）加入裂解液后，孵育15-30min。
3）离心，12,000×g，10min。【贴壁细胞离心前先把细胞刮下来】
4）收集上清到预冷的样品管中。上清可储存在-70℃。
二、应用
可以使用层析柱或免疫沉淀（IP）纯化目的蛋白。1-3mL凝胶层析柱可以纯化约100mL细胞裂解液；如样品体积较小（1-2mL细胞裂解液），可以使用免疫沉淀（IP）法；如需处理较大体积细胞裂解液，推荐使用溶液体系。
1 层析柱法
1.1 装柱
1）准备层析空柱（Cat 20520ES-20526ES）；用2-3倍柱体积的TBS（50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl）或其他适合缓冲液洗柱2次。
2）颠倒混匀Anti-Flag亲和纯化凝胶，保证凝胶均一。取1-3mL凝胶装柱（纯化约100mL细胞裂解液）。
3）用2-3倍柱体积的TBS洗2次，待液体流尽后，用3倍体积的0.1M Gly-HCl，pH3.5冲洗，要保证凝胶平面平整。Gly-HCl缓冲液处理时间不要超过20min。
4）用5倍体积TBS平衡凝胶柱，直至流出液达到中性pH。
1.2 纯化
1）上样：在层析柱中加满蛋白裂解液，重复上样2-3次可以尽可能增加蛋白与凝胶结合量。
2）清洗：用10-20倍柱体积的TBS清洗，以去除非特异结合的蛋白。
3）洗脱（可选以下2种方法之一）：
A、酸洗脱：收集管中加入15-25μL 1M Tris, pH8.0，分别用1mL 0.1M Gly-HCl，pH3.5洗脱，再重复5次。
B、3×Flag多肽（Cat 20571ES）洗脱：用TBS配制Flag多肽溶液（100μg/mL）洗脱，分别用1倍柱体积多肽溶液洗脱，重复4次。
1.3 填料再生与保存
1）柱再生：使用后立即再生，用3倍柱体积0.1M Gly-HCl，pH3.5清洗，立即用TBS平衡，直至达到中性pH.
2）保存：用10倍柱体积TBS（含50%甘油，0.02%叠氮钠）清洗，再加入5mL该溶液至柱中，保存在2-8℃或-20℃中。
2 免疫沉淀（IP）
2.1 免疫沉淀（IP）
1）充分重悬Anti-Flag亲和纯化凝胶，尽量形成均一的溶液。取40 μL混合液（20mL gel）至新的离心管中。
2）5,000-8,200×g离心30s，使凝胶沉淀在离心管底部，在加入样品前，静置1-2min。去除上清，此时要小心操作，避免吸到凝胶。
3）加入500μL TBS，轻轻的重悬Anti-Flag Affinity Gel，10,000rpm离心30s，弃上清，重复上述步骤1次。
4）可选步骤。为去除凝胶中痕量的未结合抗体，可加入500μL 0.1M glycine HCl，pH 3.5清洗凝胶，离心去除上清，加入3倍体积TBS，轻摇2-3分钟，5,000-8,200×g离心30s，弃上清，重复洗涤至上清pH为中性。Glycine HCl处理时间切勿超过20min。
5）加入200-1000μL细胞裂解液，如有必要，可用裂解液调整至终体积1mL。细胞裂解液的体积取决于Flag融合蛋白的表达量。阳性对照，需要加入1mL TBS和4μL 50ng/μL Flag-BAP融合蛋白（约200ng）；阴性对照，只要加入1mL裂解缓冲液即可（不含蛋白）。
6）4℃缓慢孵育2小时。如需提高结合效率，可延长至过夜。
7）5,000-8,200×g离心30s，去除上清。
8）上述沉淀用0.5mL TBS，轻摇混匀，5,000-8,200×g离心30s去尽上清，重复3次。
2.2 Flag融合蛋白洗脱（可选以下3种方法之一）
1）非变性洗脱（3×Flag多肽）
a. 配制3×Flag多肽洗脱液：用0.5M Tris-HCl溶液，pH7.5（含1M NaCl）溶解3×Flag多肽，终浓度为25μg/μL。用ddH2O稀释至5μg/μL，加入3μL 5μg/μL的3×Flag多肽，加入到100μL TBS中（终浓度150ng/μL）。
b. 分别加入100μL 3×Flag多肽洗脱液，4℃孵育30min（慢慢摇晃），5,000-8,200×g离心30s，转移上清至新管中（不要吸到凝胶）。如立即使用，上清可保存在4℃，-20℃长期保存。
2）酸性洗脱（0.1M Gly-HCl，pH3.5）
加入100μL 0.1M Gly-HCl，pH3.5，室温孵育5min（慢慢摇晃），5,000-8,200×g离心30s，转移上清至新管中（含10μL 0.5M Tris-HCl，pH7.5，1.5M NaCl）。注意不要吸到凝胶。如立即使用，上清可保存在4℃，-20℃长期保存。
3）用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱
加入20μL 2×上样缓冲液（125mM Tris-HCl，pH6.8，4% SDS，20%甘油，0.004%溴酚蓝），煮沸3min，5,000-8,200×g离心30s。上清可直接SDS-PAGE电泳，或WB检测。
2.3 填料再生与保存
1）再生：使用后立即再生，加入3倍凝胶体积0.1M Gly-HCl，pH3.5，轻摇3-5分钟，5,000-8,200×g离心30s，弃上清。立即用TBS平衡：加入3倍体积TBS，轻摇2-3分钟，5,000-8,200×g离心30s，收集上清测定pH，如为中性（原TBS加入前pH），则进行下一步，如仍为酸性，则重复平衡步骤。
2）保存：用10倍凝胶体积TBS（含50%甘油，0.02%叠氮钠）清洗，再加入适量该保存溶液至填料中，保存在2-8℃或-20℃中。保存缓冲液添加量，恢复至纯化前即可，体积比胶:缓冲液=1:1，可以增大缓冲液体积，缓冲液主要是提供必要的pH值和避免-20℃结冰。
3 溶液体系
1）调整蛋白裂解液pH至pH7-8，含有0.15M盐离子，如NaCl，可以降低非特异性蛋白结合。需去除Flag融合蛋白裂解液中的不溶成分。
2）重悬Anti-Flag亲和纯化凝胶，转移至新离心管中。3倍体积TBS，轻摇2-3分钟，5,000-8,200×g离心30s，弃上清，重复洗涤至上清pH为中性。
3）Flag融合蛋白裂解液与Anti-Flag亲和纯化凝胶孵育1h，在孵育过程中轻摇，以保证蛋白与凝胶充分接触。可根据情况，调整孵育时间。
4）1,000×g离心5min收集凝胶-Flag融合蛋白；
5）用10-20倍柱体积的TBS清洗凝胶，以去除非特异蛋白。
6）洗脱Flag融合蛋白【参照上述洗脱步骤】。
7）填料再生和保存【参照上述步骤】。
实验提示：
1）酸性洗脱时，Gly-HCl缓冲液处理时间不要超过20min。
2）上样缓冲液中不要加入还原剂（如DTT），还原剂会破坏抗体，如必须要加还原剂，则2×上样缓冲液中还原剂不能超过10%或100mM。
3）上样缓冲液中SDS会破坏抗体，所以Anti-Flag亲和纯化凝胶不能重复使用。
4）纯化推荐将凝胶装入层析柱中，所有溶液可以直接流过。若在管中，需反复离心除去溶液，操作繁琐。
5）除样本和裂解液外，其它溶液建议3倍体积，重复3次。可在保证纯化效果基础上适当缩减重复次数。
6）建议同时做阳性与阴性对照组。