目前，常用的细胞显微镜观测需要对细胞进行染色或标记，或通过外界激发光源对细胞成像进行分析，但这些标记以及长时间的暴光往往对细胞有一定的伤害，甚至导致细胞的死亡，无法获知细胞真实长生状况。另外传统的终点法检测，也只能得到一个简单的终点结果，无法了解细胞的动态过程，甚至失去一些重要信息，而导致不准确或错误的结论。因此，极需要一种非侵入非破坏性的细胞培养实时成像分析方法解决上述难题。目前市场上的一些非侵入技术，如：电阻抗和相差成像技术，虽然对细胞无破坏，但仍然存在着一些缺陷。相衬和干涉场显微成像技术可以拍摄高对比度的图像，电阻抗传感技术可以检测细胞数量和形态的相对变化，但不能对细胞成像。它们都不能反应细胞真实的三维形态，包括细胞的厚度和体积等参数，无法进行定量分析。

HoloMonitor™ M3使用数字全息显微镜（DHM），以激光为相干光源，利用干涉原理记录物体波前的相位和振幅信息，通过单个全息样本，数字重建标本不同深度层次的图像，并再现标本真实的三维图像，同时获得丰富的量化信息，这些信息包含着非介入实时条件下的活体细胞的光学厚度和其它形态参数及细胞动态信息。一张全息图只需要单次曝光就能获得标本三维结构的定量信息，这样不需要对样品扫描就可以拥有激光扫描共聚焦显微镜进行三维成像的优点。另外M3配备有功能强大的分析软件系统，其中包含了顶级的图像处理模块，不仅能提供整个培养体系里细胞的信息如数量、聚焦度、运动迁移等，也可以提供每张图像里单个细胞的形态学参数，如面积、厚度、体积、圆度、不规则度等。因此，M3既是一台高清3D高性能显微镜，更是一台超强的细胞分析仪。

HoloMonitor™ M3特点：

①　无标记、非侵入、非破坏性监测系统，对细胞无伤害，还原记录细胞最真实的生长状态。

②　全息定量相成像技术，获取细胞最全面的动态信息，包括传统相差显微镜无法获得的形态学参数，如细胞厚度和体积等。

③　不伤害细胞也不用杀死细胞，因此，长时间细胞培养，对同一个细胞样本可以进行连续检测。

④　细胞培养装置无特殊要求，适用于任何标准的培养皿、培养瓶，多孔板，玻片等。

⑤　自动和手动二种聚焦方式，聚焦深度可达4mm，且标本总是处于焦点上，不会造成图像模糊。

⑥　成像中区分细胞于背景的阈值自动校正及成像后手动校正功能，可经过多次重新计算和还原成像，进一步提高图像清晰度。

⑦　图像捕获既可以是单个细胞或某区域群体，也可以是多个区域群体，另外还可以延时成像。所得图片既可以以常规2D呈现，也可以是重建的3D图像。

⑧　细胞自动识别功能，分割细胞人工上色，自动细胞计数，既能分离出单个细胞单独分析，也能随意划分区域作群体对比分析。

⑨　细胞形态学测量及数据输出，所得数据可以XML格式及其它图片格式JPEG、TIFF、bitmap、PNG、GIF等输出。

HoloMonitor™ M3应用范围

 

HoloMonitor™ M3典型应用（详情可查看附件）

一、相差及定量相成像

细胞长期培养无损状态下，细胞成像，定量细胞形态和动力学参数。

二、延时成象

M3是非侵入式无损检测，不干扰细胞，也不会受光漂白或光毒性影响。配上微孵育盒及细胞培养装置，即成细胞工作站，可以长达数周实时观察细胞，进行上万次曝光而不损伤细胞，提供完美的延时成像记录，可用于神经细胞、干细胞、癌细胞等的研究。

三、细胞增殖

当使用M3进行细胞增殖研究时，不需要对细胞标记，同一样本可在长时间正常培养状态下进行多次成像检测，细胞也能用于后续其它实验。M3能进行细胞计数，同时还能获得融合数值及细胞干重，这三个参数均是细胞增殖研究的重要指标。

四、细胞分化

M3可以从细胞面积、光学厚度、体积等多方面了解细胞分化，并通过延时成像记录还原分化全过程。

五、细胞凋亡与存活

M3可以测定细胞折射率，因此不需要染色，可直接观察活细胞与死细胞，并区分凋亡细胞与死细胞。如果浆膜的完整性被破坏，细胞和周围环境的折射率差异将变得很小。如果差异是零，这个细胞则消失在背景中。因此，当观测一批细胞时，垂死的细胞将变得很薄并最终消失在背景里。

六、细胞迁移、运动与跟踪
M3成像过程中，对标本自动聚集，并对全息图像进行多次焦点计算，不受焦点漂移等聚焦干扰问题影响。因此，对细胞运动与迁移，可以给予准确的跟踪记录，并再现还原其过程，得到细胞运动平均速率、融合度对速率的影响、细胞大小、厚度和体积与速率的相关性等。

七、SiRNA研究

siRNA对细胞的作用，首先表现在细胞增殖或形态的改变。根据细胞数量及形态参数的变化，可以有效地验证siRNA的功效。

八、药理毒理研究

在药理或毒理实验中，药效、基因或蛋白对细胞增殖的调控大多首先通过形态学参数反应出来，而不是细胞数量的改变。因此，细胞形态的改变通常被作为治疗效果的早期指示。

HoloMonitor™ M3典型应用.zip 

技术指标

HoloMonitor system

技术: 数字全息技术结合相差技术

图像类型: 亮度和定量相差图像 (DH 模式)

相差图像: (PC模式)

样品载物台: 选配Z轴电动载物台或XYZ全自动载物台,移动范围150mm×120mm×20mm

CCD相机: 1280×1024 像素, 8 or 10 bits (全息图)

2048×1536像素, 8 bit (相差图)

光源:单色激光 (DH 模式)

LED光源: PC 模式)

物镜: 标准物镜10-40x

物镜支架: 4-位物镜转台，带手动或自动功能

计算机: 处理器 Intel Core i7, Memory 6GB, Hard drive 1TB, Graphics NVidia

1GB, Screen 1920x1080, Full HD, Windows 7 Professional

软件: Holostudio™ 2.3图像和细胞分析软件

 

系统性能

横向分辨率: 取决于物镜,选用 40x 物镜可达500 nm

视野: 取决于物镜,选用10x物镜可达1 mm3

工作距离: 取决于物镜, 0.3 - 18 mm

数字聚焦范围: up to 50× depth of field (objective dependent)

抓拍时间: 低于 100 μs/图像(no scanning mechanism,insensitive to vibrations)

立体取样: 1024 × 1024 pixels (全息图)

捕获速度: 4 fps (1024 × 1024 像素)

重建速度: 4 fps (512 × 512 像素), 1 fps (1024 × 1024像素)

样品照度: -0.1 mW/cm2

样品容器高度: 最大60mm

电压: 100-249 VAC - 47/63 Hz

功率(w/o PC): max. 80 W

体积(L × W × H): 650 × 360 × 560 mm

重量: 35 kg

 

样品

在任何标准细胞培养容器里的单层真核贴壁细胞，或在IBIDI 微片里的悬浮细胞

培养容器：任何标准的培养瓶或培养皿, 多孔板（最多 24-wells）, IBIDI μ-slide

微培养盒： OKO-labs的载物台培养盒

CE Mark ： EN 611010-1

 

参考文献

HAMLET Binding to a-Actinin Facilitates Tumor Cell Detachment

PLoS ONE 1 March 2011 | Volume 6 | Issue 3 | e17179

 

Reduction of the putative CD44+CD24- breast cancer stem cell population by targeting the polyamine metabolic pathway with PG11047.

Anticancer Drugs. 2010 Nov;21(10):897-906

 

Generation of trisomies in cancer cells by multipolar mitosis and incomplete cytokinesis

Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Nov 8

 

Immunomodulatory nanoparticles as adjuvants and allergen-delivery system to human dendritic cells: Implications for specific immunotherapy

VACCINE Vol 28, No. 31 (2010) 5075-5085