HB170217

Protein A/G MagBeads (IP Grade)

蛋白A/G免疫磁珠

产品信息

产品描述

Protein A/G免疫沉淀磁珠使用“纳米表面生物技术”(S-TEC)，将Protein A/G高密度定向包被到超顺磁性聚合物微球表面，具有更高的抗体结合能力和极低的蛋白非特异性吸附率，一步纯化即可从血清样品中分离出纯度>90%的抗体，使用简便有效。天然蛋白A（Protein A）是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白，二者功能相似，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG，但在两者结合特异性上有所不同（详见附录）。Protein A/G免疫磁珠同时共价偶联了蛋白A和蛋白G，比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围，实用性更高。同时，本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不仅维持其本身的Ig亲和特性，同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品适用的范围广泛，可应用于细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等样本。

产品性质

运输和保存方法

低温运输。4℃长期储存，有效期2年。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

工作液浓度应根据具体实验确定，建议进行预实验摸索最佳实验浓度。

1. 缓冲液配制

2. 抗原样品制备

本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。

血清样品处理：若目标蛋白丰度较高， 建议用结合缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10-100µg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)。

悬浮细胞样品处理：离心收集细胞（4℃, 500g, 10min），弃上清后称重，按每毫克细胞50µL的比例用1×PBS洗涤2次；按每毫克细胞5-10µL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

贴壁细胞样品处理：移去培养基，按每 1.0×10⁵个细胞150µL的比例用1×PBS洗涤两次；用细胞刮棒刮脱细胞，收集至1.5mL EP管内，按每 1.0×10⁵个细胞20-30µL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，混匀后置于冰上处理10min；离心收集上清液（4℃, 14000g, 10min），置于冰上备用（或置于-20℃长期保存）。

大肠杆菌样品处理： 离心收集大肠杆菌（4℃, 12000g, 2min）， 弃上清后称重， 按每克（湿重）菌体10mL的比例用1×PBS洗涤2次；按每克（湿重）菌体5-10mL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清（4℃, 17000g, 10min）。

3. 磁珠预处理

将磁珠漩涡振荡1min，使其充分混悬；取25-50µL（相当于50-100µg）磁珠悬液置于1.5mL EP管中。加入200µL结合缓冲液洗涤，进行磁性分离，吸弃上清，重复1次。加入200 µL结合缓冲液重悬磁珠备用。

4. 抗体结合反应

1）抗体工作液的制备：用结合缓冲液稀释抗体样品，配制成终浓度为5-50µg/mL抗体工作液，置于冰上备用。

2）抗体吸附：将步骤2预处理的磁珠悬液进行磁性分离，吸弃上清；加入200µL抗体工作液，迅速重悬后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转EP管，15min后进行磁性分离，收集上清液置于冰上以备后续检测。

3）洗涤：向EP管中加入200µL结合缓冲液，移液器轻轻吹打使磁珠-抗体复合物均匀分散，置于磁力架上，吸弃上清。重复洗涤一次。【注意：结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象，不会影响实验结果】

5. 抗原洗脱

1） 变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。

向EP管上清中加入25µL 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，95℃加热5min。将其置于磁力架上，进行磁性分离。收集上清进行SDS-PAGE检测。

B. 非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。

向EP管中加入20µL洗脱缓冲液混合均匀，室温孵育10min。将其置于磁力架上，进行磁性分离，收集上清液至新的EP管， 并立即加入1 µL 中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

常见问题

1）如何提高抗体与磁珠的结合效率?

磁珠与抗体的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关，请确认抗体的类型与 Protein A/G 配基的亲和效率（见附录）。此外，可以通过增加抗体与磁珠的孵育时间（30-120min）、提高结合缓冲液的pH值（8-9）及降低离子强度（25-100mM NaCl）等方法提高亲和效率。

2）如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性?

可以先将抗体与样品进行孵育，形成抗体-抗原复合物，再用Protein A/G磁珠捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率，并降低磁珠与样品接触的时间，从而提高沉淀产物的特异性。对于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此法。

3）如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况?

磁珠应保存在2～8℃，使用时应避免由于污染而导致的不可逆聚集，或因干燥而导致的聚集。磁珠在低pH的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在Binding buffer和Elution buffer中添加终浓度为0.1%(v/v)的非离子型去垢剂（如NP-40、Tween-20 或 Triton X-100）可有效防止磁珠聚集。经过低pH洗脱操作的磁珠可以用结合缓冲液洗涤至中性，然后用含有0.1%（v/v Tween-20的Tris buffer（pH7.5）振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。

4）磁珠在使用过程中出现结块现象?

磁珠在使用时如果出现结块现象一般较难振荡打散，容易导致分布不均，出现该问题的原因是磁珠在磁场中放置太久而使磁珠牢固的结合在一起。用超声波水浴处理2min即可打散磁珠使其重新分散，但应注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，所以磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。

5）磁珠在使用过程中出现结块现象?

建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加0.01-0.1%（v/v）的非离子型去垢剂（如NP-40、Tween-20或Triton X-100）可以有效降低磁珠对耗材的粘附。

附录. 蛋白A，G对不同物种Ig的结合能力总表