ImagenFect RNAi（IR）转染试剂使用说明

浓度：4 μM 

储存条件：4℃，长期保存建议-20℃

转染实验结束后即可观察荧光示踪，IR荧光永久、稳定

简介

IR试剂用于转染，能够将具有生物学功能的核酸或多肽转移运送到特定细胞内，并使其在细胞内维持生物功能。其中核酸包括DNA（质粒和线性双链DNA）、siRNA（用于RNAi）。转染技术已广泛应用于基因组功能研究（基因表达调控、基因沉默、信号转导和药物筛选）和基因治疗研究。

用转染试剂作为基因载体进行转染，是目前主要的转染方法，阳离子脂质体试剂是目前主要的转染试剂，但由于其转染效率低、细胞毒性高、不耐血清、不适宜体内转染等缺点限制了其应用范围。理想的基因转染试剂应该具有如下特点：(1) 高效转染；(2) 低细胞毒性；(3) 易于观察、检测；(4) 方法简单、安全；(5) 省时、经济。

ImagenFect RNAi是2010年4月纳奥生物全球首发的siRNA荧光转染试剂，也可转染DNA、多肽等生物分子，它具有高效、低毒、荧光示踪、耐血清、易靶向修饰、适合体内外转染等诸多优势。

IR分子为纳米复合材料，分子量约100kD，其作用机理为纳米粒子携带目的基因通过细胞内吞作用进入细胞，并有效促进目的基因-IR复合体从细胞内溶酶体(endosome)的释放，以及目的基因在细胞内的有效释放。IR分子最终被分解排出细胞外，可用荧光显微镜观察转染过程。

在合理操作及良好实验条件的前提下，IR能达到90%以上细胞转染效率（即超过90%细胞被成功转染）。

1.      适用范围

IR适用于RNA、DNA在各类肿瘤细胞及常规细胞系如CHO、Hela、293T、Jurkat等细胞的转染。

2.      细胞培养

按照表1推荐的细胞数量和培养基量，提前一天将细胞种植在培养容器中。转染时细胞汇合度在50%-80%可以达到最佳转染效率，如果追求比较好的荧光图片，可在30%-40%进行转染。（由于本品细胞毒性较小，可采用较小的细胞汇合度，更适合转染后的观察）

表1 细胞接种数量、培养液体积、IR用量推荐

注：平板培养基是在转染时直接加入孔板中用以混合培养好的细胞，稀释培养基是指目的基因及IR试剂分别分散于一定体积的培养基中，然后再与平板培养基混合，每孔培养基总体积为二者之和

   

3.      siRNA转染

（1）    试剂用量

IR用量是与siRNA最终摩尔浓度按1:1使用，IR正式装的浓度是4 μM，即4 nmol/ml，如果加x pmol的siRNA，就加x/4 μl的IR试剂。如每孔转染20 pmol的siRNA（24孔板），则添加5 μl的IR，1ml的IR试剂可以使用200次。

其他规格的培养容器请参考表1。

（2）    操作说明

如冷冻保存，则先将IR解冻，并离心收集管壁附着液体。

以24孔板为例。转染前，用PBS轻轻漂洗贴壁细胞，加入500 μl OpitMEM培养液与孔板中。将20 pmol siRNA分散于50μl OpitMEM，将5 μl IR分散于50μl OpitMEM后，将两组OpitMEM分散液等体积混合。在微型振荡器上剧烈震荡10s后，室温静置20 min，然后加入24孔板内细胞OpitMEM培养液中（每孔共600 μl OpitMEM培养液，符合表1推荐量）。培养4-6小时后更换培养基，可在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察siRNA转染结果。继续培养至24-72小时在mRNA水平检测实验结果，培养至24-96小时可以在蛋白水平验证基因沉默实验结果。

注：IR可以在含血清和抗生素培养液环境中进行转染实验，即使用普通培养基来代替OpitMEM，并且无需再更换培养基。为了获取更优的转染效率，建议采用上述实验流程。

（3）    数据结果

图1 ImagenFect (IR)转染Cyclophilin B siRNA至Hela细胞转染效率Western blot结果比较，以转染试剂Lipofectamine，TransIt，JetPEI等转染试剂作阳性对照

结果表明，IR对siRNA 转染效率比Lipofectamine提高至18倍。

 

图2 ImagenFect对转染细胞存活率影响实验比较

结果表明，ImagenFect没有细胞毒性，而Lipofectamine和Jet-PEI显示较高的细胞毒性。

图3 ImagenFect 转染FITC标记siRNA至SKBR-3乳腺癌细胞动态转染荧光示踪过程。（红色为ImagenFect纳米粒子，绿色为siRNA分子）

结果表明，ImagenFect能够靶向转运siRNA分子进入肿瘤细胞，并实现细胞质内有效释放。可从转染后0min至5h用荧光显微镜实时观察转染过程，并拍摄荧光图片。

4. DNA转染

（1）    试剂用量

以24孔培养板为例，当转染DNA时，如DNA长度为5000 bp左右，则建议每孔转染1 μg的DNA，添加2.5 μl的IR，1 ml的IR试剂可以使用400次。

具体每种培养容器对应的DNA及IR试剂用量可参考表1。

（2）    操作说明

如冷冻保存，则先将IR解冻，并离心收集管壁附着液体。

以24孔板为例，转染前，将1 μ, g质粒DNA混合于50 μl含5% 小牛血清的RPMI1640或McCoy 5A培养液内，得到培养液①，室温静置10分钟；另将2.5 μl的IR转染试剂混合于50 μl含5% 小牛血清的RPMI1640或McCoy 5A培养液内，充分吹打混匀得到培养液②，室温静置10分钟。将②逐滴加入到①内混匀，置于微型振荡器振荡10s，离心（1000rpm 1min）收集混合液于样品管底，室温静置20min。在24孔细胞培养板内加入0.5 ml含5%小牛血清的培养液，然后逐滴加入IR/DNA混合液。随后可用荧光显微镜实时观察转染过程。转染后8小时用培养基清洗转染细胞表面，以除去游离的DNA及未结合的IR分子，并可更换为含10%小牛血清的常规培养液，继续培养至24小时，检验转染效果。

（3）    数据结果（以下数据结果为纳奥公司客户提供）

人卵巢癌SKOV3细胞

转染后24小时，在人卵巢癌细胞满视野分布的镜头下，能看见很多细胞发出荧光，表明转染效率较高。转染率能达到80%以上。

图4 IR转染GFP质粒DNA至人卵巢癌SKOV3细胞24小时后荧光图片

人293T细胞

转染后24小时，在人293T细胞满视野分布镜头下，能看见大多数细胞发出荧光，表明转染效率较高。转染率能达到90%以上。

图5 IR 转染GFP质粒DNA至人293T细胞24小时后荧光图片

人肺癌细胞PG细胞

转染后24小时，在人PG 细胞满视野分布镜头下，能看见大多数细胞发出荧光，表明转染效率较高。转染率能达到90%左右。

图6 IR 转染GFP质粒DNA至人肺癌细胞PG细胞24小时后荧光图片

5. 质量保证

纳奥生物医药有限公司对ImagenFect RNAi转染试剂的每批产品实行严格质量检验，并进行转染验证，以确保产品质量，提供技术支持。如该试剂存在任何质量问题，而非操作不当造成，本公司将免费提供更换。请用户使用前务必认真阅读说明。

6. 参考文献

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