英文名称： Hieff Clone™ One Step Pcr Cloning Kit
试剂级别： 分子生物学级
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒
产品信息
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒产品描述
Hieff CloneTM One Step Pcr Cloning Kit一步法（快速/无缝）克隆试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，可高效克隆50 bp～10 kp片段。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。
试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶Exnase，Exnase中添加了独特的重组增强因子，显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107 cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)，而且Exnase还兼容常规酶切、PCR反应体系。
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒产品组分
冰袋（wet ice）运输。产品-20 ºC保存。
实验流程
实验流程概览
1) 线性化克隆载体制备；
2) 插入片段扩增引物设计；
3) 插入片段PCR扩增；
4) 进行重组反应；
5) 反应产物转化、涂板；
6) 克隆鉴定。
图一 实验流程概览
注：插入片段PCR扩增时，引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列 (图中以蓝色和橙色标记)，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。
1. 制备线性化克隆载体
选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。
线性化载体可通过限制性内切酶酶切（单酶切或双酶切）或反向PCR扩增获得。
A．酶切制备线性化克隆载体
双酶切线性化：线性化完全，转化背景 (假阳性克隆) 低。推荐使用。
单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
注：1）Hieff CloneTM重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱***酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。
2）Hieff CloneTM重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活)后可直接用于重组反应。
B．反向PCR扩增制备线性化克隆载体
推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (HieffTM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
Hieff CloneTM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
克隆载体酶切产物或PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(>5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。
表一：线性化克隆载体的使用方式
注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl（重组反应总体积的1/5）
2. 制备PCR产物
2.1设计扩增引物
Hieff CloneTM引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。
正向扩增引物设计方式：
5’——上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列——3’
反向扩增引物设计方式：
3’——基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列——5’
基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；
上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列（用于同源重组）。
以pUC18作为克隆载体为例，引物设计方案如图二所示。
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图二 重组引物设计方案
注：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。
2.2 插入片段PCR扩增
插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A加尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增(HieffTM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60)，以减少扩增突变的引入。
PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff CloneTM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(>5 kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。
表二：扩增产物推荐使用方式
注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl（重组反应总体积的1/5）
*当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI 失活，以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。
3. 重组反应
3.1 配制反应体系
于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
Hieff CloneTM重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03 pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
最适克隆载体使用量 = [0.02×克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)
最适插入片段使用量 = [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol)
例如，将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用量应为：0.02 × 5000 = 100 ng; 插入片段最适使用量应为：0.04 × 2000 = 80 ng。
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒注：1. 当插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体/克隆载体当做插入片段进行计算。
2. 线性化克隆载体的使用量应在50～200 ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在20～200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。例如，插入片段长度为100 bp，最适使用量计算值为 4 ng，实际反应体系内使用量应为插入片段扩增产物最少使用量 20 ng。
3. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4 μl。
4. 试剂盒中提供500 bp control insert (25 ng/μl) 和pUC19control vector, linearized (50 ng/μl) 各5 μl，需要时可进行阳性对照反应，每次反应各加1 μl。
3.2 重组反应
1) 体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀) 。
2) 置于37℃反应30 min。
3) 待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。
4) 反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
注：我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30 min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
4. 重组产物转化、涂板
1) 取20 μl冷却反应液，加入到200 μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。
2) 42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2 min。
3) 加入900 μl SOC或LB培养基，37℃孵育10 min充分复苏。37℃摇菌45 min。
4) 取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
注：我们推荐您使用转化效率>108 cfu/μg的感受态细胞。如果感受态转化效率<108 cfu/μg(例如用CaCl2法新鲜制备的感受态转化效率通常在106-107 cfu/μg之间) ，请将培养菌液在5000 rpm离心3 min收集菌体，用100 μl LB培养基重悬后全部涂板。
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒5. 克隆鉴定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20～50 μl LB 培养基中混匀，直接取1 μl作为PCR模板。
我们推荐您至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。
将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜，提取质粒做后续的鉴定。