多片段一步法快速克隆试剂盒产品描述

Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的多片段DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶的催化下，仅需反应15-50 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。

试剂盒中2×Hieff Clone MultiS Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了独特的重组增强因子，可显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (10⁷cfu/μg)也可实现高效克隆 (100cfu/ng Vector)，使用该试剂盒，可以一次实现多至5个片段的顺序拼接克隆。重组体系还兼容常规酶切、PCR反应体系。

该试剂盒可用于多片段拼接克隆、全基因合成和DNA定点突变。

 多片段一步法快速克隆试剂盒产品组分

* 酶最适反应温度是50℃。

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。产品-20 ºC保存。

实验流程

实验流程概览

1）线性化克隆载体制备；

2）插入片段扩增引物设计；

3）插入片段PCR扩增；

4）进行重组反应；

5）反应产物转化、涂板；

6）克隆鉴定。

图一 实验流程概览

1. 制备线性化克隆载体

选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。

线性化载体可通过限制性内切酶酶切（单酶切或双酶切）或反向PCR扩增获得。

A．酶切制备线性化克隆载体

双酶切线性化：线性化完全，转化背景 (假阳性克隆) 低。推荐使用。

单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。

【注】：1）Hieff Clone^TM Plus MultiS重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱***酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。

2）Hieff Clone^TM Plus MultiS重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活)后可直接用于重组反应。

B．反向PCR扩增制备线性化克隆载体

推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (Hieff^TM Pfu DNA Polymerase，Cat No. 10113ES60) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。

Hieff Clone^TM Plus MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。

克隆载体酶切产物或PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(>5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体)。不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。

表一：线性化克隆载体的使用方式

【注】：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl（重组反应总体积的1/5）

2. 制备PCR产物

 多片段一步法快速克隆试剂盒2.1设计扩增引物

Hieff Clone^TM Plus MultiS引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15bp～25bp)。

首先设计第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物(与载体相邻的两个插入片段)。

第一片段正向扩增引物设计方式：

5’——上游载体末端同源序列+第一片段基因特异性正向扩增序列——3’

第三片段反向扩增引物设计方式：

3’——第三片段基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列——5’

基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；

上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列（用于同源重组）。

以pUC18作为克隆载体、进行三插入片段顺序拼接克隆（5’至3’按克隆顺序依次为：第一片段、第二片段、第三片段）为例，引物设计方案如图二所示。

图二：重组引物设计方案

【注】：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。

其次设计第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物。用于片段之间进行重组的同源序列可以添加至前方片段的反向扩增引物中，也可以添加至后方片段的正向扩增引物中，还可以两片段各添加一部分。以将同源序列添加至前方片段 (第一片段)的反向扩增引物中为例，引物具体设计方案如图三所示：

第一片段反向扩增引物设计方式：

3’——第一片段基因特异性反向扩增序列+第二片段5’端同源序列——5’

第二片段正向扩增引物设计方式：

5’——第二片段基因特异性正向扩增序列——3’

基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；第二片段5’端同源序列即用于第一片段与第二片段进行重组的添加序列。

最后设计第二片段的反向扩增引物和第三片段的正向扩增引物。设计方式与第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计方式一致。具体方案参见图三。

图三：第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计示意图

 多片段一步法快速克隆试剂盒【注】：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。

2.2 插入片段PCR扩增

插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。聚合酶进行扩增(Hieff^TM Pfu DNA Polymerase，Cat No. 10113ES60)，以减少扩增突变的引入。

PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff Clone^TM Plus MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。

PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段(>5kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。

表二：扩增产物推荐使用方式

【注】：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl（重组反应总体积的1/5）

*当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20min将DpnI 失活，以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。

3. 重组反应

3.1 配制反应体系

于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

Hieff Clone^TM Plus MultiS 重组反应体系最适DNA使用量为每片段（包括线性化克隆载体）0.03pmol。该摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

每片段最适使用量= [0.02×克隆载体碱基对数]ng (0.03pmol)

例如，将长度为0.5kb、1kb、2kb三插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时，各片段最适使用量应为：线性化克隆载体最适使用量：0.02 × 5000 = 100ng

0.5kb插入片段最适使用量应为：0.02 × 500 = 10ng

1 kb插入片段最适使用量应为：0.02 × 1000 = 20ng

2 kb插入片段最适使用量应为：0.02 × 2000 = 40ng

【注】：① 线性化克隆载体的使用量应在50～200ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。

② 插入片段DNA使用量应大于10ng。当使用上述公式计算DNA最适使用量低于这个值时，直接使用10 ng即可。

③ 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4 μl。

④ 试剂盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)和Control insert Mix (0.5kb, 10ng/μl; 1kb, 20ng/μl; 2kb, 40ng/μl)各5μl，需要时可进行阳性对照反应，每次反应各加1μl。

3.2 重组反应

体系配制完成后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀) 。

1）置于50℃反应20-50min。

【注】：当插入片段总和≥5kb的时候，建议提高孵育时间到30-50min可以增大重组效率。

2）待反应完成后，建议将反应管置于冰上冷却5min，目的是降低温度，以防温度过高降低感受态转化效率。

3）反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

【注】：我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。