(gDNA digester plus)

产品信息

产品描述

Hifair^TM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有基因组DNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair^TM Ⅱ Reverse Transcriptase而开发。与Hieff^TM M-MLV (H^-) Reverse Transcriptase相比，Hifair^TM Ⅱ Reverse Transcriptase热稳定性和cDNA合成效率大幅度提高。

该试剂盒包含gDNA digester，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers和oligo (dT)₁₈，用户可根据需要，选择Random Primers，Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

产品组分

【注】：1) 5×Hifair^TM Ⅱ Buffer plus包含dNTP和gDNA digester抑制剂；

2) Hifair^TM Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存。

注意事项

1）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染；

2）如果加入RNA模板体积较大 (如超过2 μL)，请确保RNA是溶于水中而不是TE中，因为TE会对gDNA去除以及逆转录反应产生抑制；

3）可以不经过基因组去除步骤，直接进行逆转录，这样所得到的结果会与使用Hifair^TM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Cat No. 11119ES）效果一致。但是请勿将gDNA digester与11119ES中的5×Hifair^TM Ⅱ Buffer配套使用，因其不含终止gDNA digester反应的成分，会影响反转录和后续的qPCR实验；

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

引物选择

1. 若后续为PCR实验

1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)₁₈ ，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2）基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成时，可改用Oligo (dT)₁₈或Random Primers重新进行逆转录。

3）Random Primers特异性较低，所有RNA，包括mRNA、rRNA、tRNA均可作为Random Primers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，且使用Oligo (dT)₁₈或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，可使用Random Primers作为引物。

2. 若后续为qPCR实验

建议将Oligo (dT)₁₈和Random Primers混合使用，可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成，有助于提高定量结果的重复性。

第一链cDNA合成操作步骤

一、若后续为PCR实验

1. 残留基因组DNA去除

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

3. 逆转录程序设置

【注】：1）当使用Random Primers时，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers，此步可省略；

2）逆转录温度：推荐使用50℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到55℃。

※ 逆转录产物可立即用于后续PCR反应，也可-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。