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细胞模型构建、鉴定、增殖、转染服务
服务项目简介
细胞转染即把核酸导入细胞。常规转染技术分为两类：瞬时转染和稳定转染。瞬时转染外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，通常可持续几天（1-3天）。稳定转染需要通过一些选择性标记来进行反复筛选得到稳定转染的同源细胞系。目前使用广泛的是脂质体介导法，另有很多商品化的转染试剂可供选择。
技术方法、原理及应用
转染方法 |
原理 |
应用 |
特点 |
磷酸钙法 |
磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞 |
稳定转染、瞬时转染 |
不适用于原代细胞，转染效率高，对细胞毒性小，但技术要求很高 |
电穿孔法 |
高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入 |
稳定转染，瞬时转染 |
简单，可重复性高 对细胞有毒副作用 转染时需除血清 |
阳离子脂质体法 |
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 |
稳定转染，瞬时转染 |
适用性广，转染效率高，重复性好，转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大 |
病毒介导法 |
通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 |
稳定转染 |
用于难转染的细胞，原代细胞，体内细胞等 |
技术步骤（脂质体法）
（1）脂质体介导的质粒DNA转染法
① 转染前一天接种细胞，细胞密度在40-60%，每孔加培养基2 ml （六孔板，无抗生素）。
② 细胞接种23小时后用1.5 ml Opti-MEM更换旧的培养液以提高转染效率。
③ 换液1小时后开始转染质粒，按如下步骤准备质粒-转染试剂混和液：
250 μlyou化培养基稀释10 μl的转染试剂Lipofectamine 2000，轻轻混和且在室温孵育5min；
250 μlyou化培养基稀释4 μg质粒，轻轻混和并在室温孵育5min；
将稀释的质粒和稀释的转染试剂轻轻混和，室温培养30min以形成质粒-转染试剂混和物。
④ 将质粒-转染试剂混和液加入每个含有细胞及培养液的孔中，轻轻摇晃孔板混和。
⑤ 培养6-7小时换液，换成细胞正常生长所需培养基。
⑥ 在CO2培养箱中培养24-48小时，Real-time-PCR或Western blot检测表达效果。
（2）脂质体介导的siRNA转染法
① 转染前一天接种细胞，细胞密度在30-50%，每孔加培养基2 ml （六孔板，无抗生素）。
② 细胞接种后23小时后用1.5 ml Opti-MEM更换旧的培养液以提高转染效率。
③ 换液1小时后开始转染siRNA，按如下步骤准备siRNA-转染试剂混和液：
250 μlyou化培养基稀释10μl的转染试剂LipofectAMINE 2000，轻轻混和且在室温孵育5min；
250 μlyou化培养基稀释50 nM siRNA，轻轻混和并在室温孵育5min；
将稀释的siRNA和稀释的转染试剂轻轻混和，室温培养30min以形成siRNA-转染试剂混和物。
④ 将siRNA-转染试剂混和液加入每个含有细胞及培养液的孔中。轻轻摇晃孔板混和。
⑤ 培养6-7小时换液，换成细胞正常生长所需培养基。
⑥ 在CO2培养箱中培养24-48小时，Real-time PCR或Western blot检测干扰效果。
（3）稳定的脂质体转染
① 转染方法同前
② 在转染后24小时，消化细胞，并将细胞接种于96孔板，每孔1-2个细胞以便进行单克隆筛选。24小时后，加入适量抗生素（根据质粒所带的筛选标记）筛选，得到稳定表达的细胞。
应用领域
- 瞬时/稳定高表达细胞的构建、鉴定和增殖
- 瞬时/稳定干扰表达细胞的构建、鉴定和增殖
- 带有报告基因或标签的瞬时/稳定高表达细胞的构建、鉴定和增殖
- 带有报告基因或标签的瞬时/稳定干扰表达细胞的构建、鉴定和增殖
实用实例
高表达载体 脂质体转染293细胞24小时
服务周期
我公司在正式接受实验委托1~2个月左右交付构建好的细胞株。
服务咨询及技术支持
电话:
Email: slby800@163.com
